肺炎链球菌核酸检测试剂国家参考品的研制及验证
李康*
* 黄洋* 王春娥 李江姣 梁丽 陈驰 刘茹凤 叶强 中国食品药品检定研究院生物制品检定所细菌多糖和结合疫苗室，北京102629
［基金项目］国家科技重大专项课题(2018ZX10102 - 001-
002、2018ZX09738006-006)；国家科技基础条件平台一国家
菌种资源库课题(NMRC-2020-2)遥
［作者简介］李康(1982.5-)，男，博士，主要从事呼吸道细菌 疫苗质量控制、国家标准医学菌种检定和诊断试剂研究工作。
*
共同第一作者
［通讯作者］叶强(1964.12-)，男，硕士，主任技师，中国食品 药品检定研究院细菌多糖和结合疫苗室
主任，主要从事细 菌多糖和结合疫苗质量控制和国家标准医学菌种资源的保
藏、研究及应用工作。
［摘要］目的研制肺炎链球菌核酸检测试剂国家参考品，并进行适用性验证。方法选择10株肺炎链球菌和10株 非肺炎链球菌细菌制备成阳性参考品、阴性参考品、重复性参考品和最低检出限参考品遥对参考品的分装均匀性
和稳定性进行评估。采用4家企业生产的肺炎链球菌核酸检测试剂盒对制备的肺炎链球菌国家参考品进行准确 性、特异性、重复性和最低检出限验证。结果参考品的分装均匀度良好，循环阈值的变异系数均在5.00%.以内。
2~8益、室温(25益)和37益放置3、7 d 及反复冻融3、5次都不影响参考品的稳定性。4家企业的试剂盒的准确性、
特异性及重复性检测结果均符合要求。1家企业的试剂盒的最低检出限为1.0伊104个/mL，其他3家企业的试剂盒
的最低检出限为1.0伊103个/mL 遥结论研制完成一套肺炎链球菌核酸检测试剂国家参考品，能够用于肺炎链球 菌核酸检测试剂盒的质量控制和评价。
［关键词］肺炎链球菌；核酸检测试剂；国家参考品；质量评价冲图分类号］R378.1
［文献标识码］A
［文章编号］1673-7210(2021)05(C )-0141-04
Preparation and validation of a national reference for nucleic acid test
reagent of Streptococcus pneumoniae
LI Kang' HUANG Yang' WANG Chun ' e LI Jiangioo LIA NG Li CHEN Chi LIU Rufe n g YE Qiang
Division of BacLerial Polysaccharide and Conjugate Vaccines, InsLiLuLe for Biological ProducL ConLrol, National InsLi-
LuLes for Food and Drug ConLrol, Beijing 102629, China
[Abstract] Objective To prepare a naLional reference for nucleic acid LesL reagenL of Streptococcus pneumonicae and
validaLe iLs applicabiliLy. Methods Ten sLrains of Streptococcus pneumoniae and Len sLrains of non -Streptococcus
pneumoniae were selecLed Lo prepare posiLive reference, negaLive reference, repeaLable reference and minimum deLec-
Lion limiL reference. The uniformiLy and sLabiliLy of Lhe reference package was evaluaLed. The accuracy, specificiLy, re- producibiliLy and minimum deLecLion limiL of Lhe prepared naLional reference of Streptococcus pneumoniae were vali-
daLed by using nucleic acid deLecLion kiLs of Streptococcus pneumoniae produced by four enLerprises. Results The packing uniformiLy of Lhe reference was good, and Lhe coefficienL of variaLion of Lhe cycle Lhreshold values were all
wiLhin 5.00%、The sLabiliLy of Lhe reference was noL affecLed by being placed for Lhree or seven days aL 2-8益，room LemperaLure （25益） and 37益 and repeaLed freezing-Lhawing for Lhree or five Limes. The accuracy, specificiLy and repro-
ducibiliLy of Lhe kiLs from Lhe four enLerprises were all in line wiLh Lhe requiremenLs. The
minimum deLecLion limiL of Lhe kiLs from one enLerprise was 1.0x104/mL, and Lhe minimum deLecLion limiL of Lhe kiLs from Lhe oLher Lhree enLer
prises was 1.0x103/mL. Conclusion A seL of naLional reference reagenLs for nucleic acid LesL reagenL of Streptococcus
pneumoniae has been prepared, which can be used for Lhe qualiLy conLrol and evaluaLion of Streptococc us pneumoniae nucleic acid deLecLion kiLs.
[Key words] Streptococcus pneumoniae; Nucleic acid LesL reagenL; NaLional reference; QualiLy evaluaLion
肺炎链球菌是引起儿童肺炎链球菌性疾病的主
要病原菌［1］遥肺炎链球菌也是新型冠状病毒肺炎感染
病例合并感染的主要呼吸道病原菌［2-4］遥根据荚膜多糖 抗原的不同，肺炎链球菌可以分为90多种血清型叫 早期及时准确的诊断有助于肺炎链球菌性疾病的临
床。近年来，荧光定量PCR 方法［6-7］、生物芯片法叭
PCR 毛细电泳片段分析法［9-10］、数字PCR 法［11］和测序
法旧等核酸检测技术迅速发展，促进了肺炎链球菌核 酸检测试剂的研发遥不同的试剂检测时取用的样本量
及检测的目的基因不同，其检测结果的一致性及灵敏
度存在差异。目前，国内尚无统一的肺炎链球菌国家
CHINA MEDICAL HERALD Vol. 18 No. 15 May 2021 |l41
参考品用于此类核酸检测试剂的质量控制和评价。因此，本研究拟研制肺炎链球菌核酸检测试剂国家参考品，以期用于肺炎链球菌核酸检测试剂的质量控制与评价。1材料与方法
1.1菌种
参考品制备用菌株均来源于中国医学细菌保藏管理中心（CMCC）。见表1。
____________________________________________________表1参考品菌株信息
参考品类型菌株名称数量（株）阳性参考品肺炎链球菌31001、31439、31477、31495、31310、3169
4、31705、31761、31228、3126710阴性参考品A族链球菌32067、流感嗜血杆菌58561、肺炎克雷伯菌46117、脑膜炎奈瑟菌29052、金黄葡萄球菌26001、铜绿10假单胞菌10104、链球菌（h）32116、链球菌（（：）32134、卡他布朗汉姆菌29118、白喉棒状杆菌38102
重复性参考品肺炎链球菌310011
最低检出限参考品肺炎链球菌310011
1.2主要试剂及仪器
哥伦比亚血琼脂（货号：279240）、Todd Hewitt Broth （货号:249240）和Yeast extract（货号：212750）均购自BD公司；中国细菌浊度标准国家标准品（批号：230021-201960）由中国食品药品检定研究院提供；肺炎链球菌核酸检测试剂盒A（批号:20200201）、B（批号:2020 0325）、C（批号:20200602）和D（批号:P2*******）分别购自4家肺炎链球菌核酸检测试剂生产企业。NU-5810E型二氧化碳培养箱购自NUAIRE公司；ABI7500型荧光定量扩增仪购自ABI公司遥
1.3菌悬液的制备
将参考品菌株分别接种于适宜生长的培养基上，于最适温度下进行培养。取固体培养物或经离心收集的液体培养物沉淀，用灭菌生理盐水重悬后制备成菌悬液。采用比浊法［13-14］或平皿计数法问测定菌
悬液的浓度遥菌悬液经热灭活处理后，稀释至适当浓度，用于参考品的制备。
1.4参考品的制备
将10株阳性参考品肺炎链球菌菌悬液稀释至1.0伊107个/mL制备阳性参考品（P1-P10）各150支，
0.5mL/支遥将脑膜炎奈瑟菌29052菌悬液稀释至
1.0伊106个/mL，其余9株阴性参考品菌悬液稀释至1.0伊107个/mL制备阴性参考品（N1~N10）各150支，0.5mL/支。将肺炎链球菌31001菌悬液稀释至1.0伊107个/mL制备重复性参考品渊R）450支和最低检出限参考品（S）150支,0.8mL/支。1套肺炎链球菌国家参考品由阳性参考品（P1~P10）各1支、阴性参考品（N1~N10）各1支、3支重复性参考品和1支最低检出限参考品组成,-20益及以下保存。
1.5参考品的分装均匀性评估
随机抽取阳性参考品（P1~P10）和最低检出限参考品各10支，重复性参考品15支，用试剂盒C进行检测，重复2次。计算循环阈值（Ct值）的均值、标准差（SD）及变异系数（CV）。
142CHINA MEDICAL HERALD Vol.18No.15May20211.6参考品的稳定性评估
将阳性参考品（P1~P10）、最低检出限参考品各9支分别于2~8益、室温渊25益）,37益放置3、7d，反复冻融3次、5次，以-20益保存的参考品作为对照，用试剂盒B进行检测，重复2次。考察参考品于不同温度下放置不同时间及反复冻融的稳定性遥
1.7参考品的验证
分别用4种肺炎链球菌核酸检测试剂盒对参考品进行验证。准确性验证：检测阳性参考品（P1~P10）各1支，应全部为肺炎链球菌阳性。特异性验证：检测阴性参考品（N1~N10）各1支，应全部为肺炎链球菌阴性。重复性验证：合并3支重复性参考品后进行检测，重复检测10次，应全部为肺炎链球菌阳性，且Ct 值的CV应臆5.00%遥最低检出限验证：检测最低检出限参考品1支，用灭菌生理盐水10倍系列稀释，取1.0x105a1.0x104a1.0x103和1.0伊102个/mL共4个稀释度，验证试剂盒的最低检出限。
2结果
2.1参考品的分装均匀性评估
试验结果显示，阳性参考品（P1~P10）、最低检出限参考品及重复性参考品Ct值的CV均在5.00%以内，说明参考品的分装均匀度良好。见表2遥
表2参考品的分装均匀度评估
编号Ct均值（循环数）SD CV渊%)
P126.220.31 1.20
P224.710.25 1.00
P325.770.29 1.12
P425.460.150.58
P526.630.220.81
P626.760.31 1.17
P724.170.32 1.33
P824.170.220.92
P923.970.44 1.85
P1025.480.90 3.53
S23.790.230.96
R24.030.47 1.96
注:Ct值：循环阈值；SD：标准差；CV：变异系数
2.2参考品的稳定性评估
使用Kruskal-Wallis非参数检验对参考品稳定性数据进行分析。结果显示，参考品经反复冻融3、5次处理后的Ct值与-20益保存的对照参考品的Ct值比较，差异无统计学意义（P>0.05），表明本参考品反复冻融3~5次不影响其稳定性遥将参考品分别于2~ 8益、室温（25益）和37益放置3、7d后的Ct值与-20益保存的对照参考品的Ct值比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明本参考品在2~8益、室温（25益）和37益放置3、7d不影响参考品的稳定性，可以满足运输、使用等的稳定性要求，见表3遥
2.3参考品的验证
结果显示,4家企业的试剂盒的准确性、特异性及重复性检测结果均符合要求。阳性参考品的符合率均为10/10，阴性参考品的符合率均为10/10，重复性参考品的Ct值的CV均臆5.00%。1家企业的试剂盒的最低检出限为1.0X104个/mL，其他3家企业的试剂盒的最低检出限为1.0伊103个/mL。见表4遥
3讨论
本研究从CMCC选择了20株菌株作为参考品制
表3不同处理条件下参考品Ct值的变化
编号
反复冻融2〜8益室温（25益）37益
-20益（对照）3次5次-20益（对照）3d7d-20益（对照）3d7d-20益（对照）3d7d
P123.1323.9324.9523.2123.8524.8723.5824.0924.8223.0223.9524.62
P223.3424.3825.0123.6624.2224.6723.9523.6124.5323.8123.3523.75
P323.0723.4823.6823.1424.0723.8623.7224.0224.0823.0623.8624.26
P423.6124.7224.9223.6925.0525.1024.2225.2425.2423.9424.4724.89
P524.7324.6525.0023.7424.7324.5523.9924.5425.8623.9425.1025.25
P624.9127.0125.5325.0426.6026.8525.3427.0827.2924.8825.9627.30
P724.7325.8826.2224.7225.5426.0924.8726.2725.6425.0025.6026.41
P824.6225.0525.2424.3024.7125.5824.9725.2925.4524.3625.3725.43
P924.0426.0625.0724.1225.4825.0324.7625.6326.7424.3324.7024.65
P1026.3627.7228.1426.3427.3328.9026.8227.9328.8626.3827.4326.44
S623.3424.3924.7723.3624.5624.4623.8024.4024.9923.5624.7024.37
S526.0627.5827.4426.0227.7427.8826.2427.4427.8826.1527.7828.02
S429.7730.4031.1329.8430.4331.2730.0430.7431.3229.4630.6431.74
S332.2734.1733.9032.3332.9932.9633.0533.8736.1332.5233.6236.70注:S6、S5、S4和S3分别为最低检出限参考品S经不同处理后的浓度为1.0X106个/mL,1.0x105个/mL、1.0x104个/mL和1.0伊103个/mL的稀释液。Ct值：循环阈值
表4不同企业试剂盒的验证结果
试剂盒编号P1~P10N1~N10Ct值的CV渊%) 1.0X105个/mL 1.0X104个/mL 1.0X103个/mL 1.0X102个/
mL
核酸检测结果阳性参考值阴性A+/+(10/10)-/-(10/10) 1.26+++-
B+/+(10/10)-/-(10/10) 1.11+++-
C+/+(10/10)-/-(10/10)0.93+++-
D+/+(10/10)-/-(10/10)0.40++--注:"+/+（10/10）”表示10个阳性参考品（P1~P10）全部为肺炎链球菌阳性；"-/-（10/10）”表示10个阴性参考品（N1~N10）全部为肺炎链球菌阴性；“+”表示检出;“-”表示未检出遥Ct值：循环阈值；CV：变异系数
备用菌株，其中阳性参考品菌株的选择考虑了19A、19F、14、3和23F等流行血清型或血清［16-18］及有趋势上升的血清型15A和35B［19切。阴性参考品菌株的选择充分考虑了与肺炎链球菌感染部位相同或感染症状相似且常见的其他病原体，以及同属不同种的干扰菌株，包括A族链球菌［21］、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌［22］、脑膜炎奈瑟菌、金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、链球菌（b）、链球菌（c）、卡他布朗汉姆菌和白喉棒状杆菌。
根据标准物质的研制要求［23-24］，本研究对参考品的均匀性和稳定性进行了评估。参考品的分装均匀性满足要求。稳定性评估结果显示参考品经反复冻融3、5次及2~8益、室温渊25益）、37益放置3、7
d，不影响其稳定性。为了保证参考品的长期供应需求，还需要持续收集参考品长期稳定性数据，以评价其长期储存的稳定程度［25-26］遥
使用4家企业生产的试剂盒对肺炎链球菌国家参考品进行适用性验证，其准确性、特异性和重复性检测结果均符合要求，但最低检出限存在差异遥验证结果表明，本参考品可以用于不同企业生产的试剂盒的关键指标的有效评价何。由于不同的试剂盒的检测原理不同，今后还需要用不同原理研发的核酸检测试剂盒进行验证。
综上所述，本研究研制完成一套肺炎链球菌核酸CHINA MEDICAL HERALD Vol.18No.15May2021|l43
检测试剂国家参考品，能够用于肺炎链球菌核酸检测试剂盒的质量控制和评价。
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144CHINA MEDICAL HERALD Vol.18No.15May 2021
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