胃肠病学2020年第25卷第10期
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*论
高脂饮食小鼠胆囊胆固醇结石模型 特征分析和肝脏转录组学研究*
D0D 10. 3969/j. itd. 1008 9125. ZOZO. 10. OH *基金项目：国家自然科学基金(81870452)
# Email : ********************
& 本文通信作者,Email : Pwadxmjian2526@ 120. com
庄 谦*董志霞 叶 欣程金年 宛新建&
上海交通大学附属第六人民医院消化内镜中心（200233）
背景：高脂饮食诱导的小鼠胆囊胆固醇结石模型是胆囊结石成因及其防治研究常用的动物模型。目的：探
讨
高脂饮食小鼠胆囊胆固醇结石模型特征并进行肝脏转录组学研究。方法：20只雄性C57BL/CJ 小鼠随机分为2组,
分别予普通饲料喂养（对照组）和成石饲料喂养［成石饮食（LD ）组］。喂养8周后观察胆囊结石形成情况，检测血 脂和胆囊胆汁脂质成分，采用Eumma 高通量测序技术筛选模型小鼠肝脏组织差异表达基因，并进行G0和KEGG 富集分析。采用real-time PCR 验证肝脏胆汁酸合成相关基因表达。结果:LD 组小鼠胆囊胆固醇结石成石率为
100%，对照组无结石形成。LD 组小鼠存在明显的肝大和肝脏脂肪变性，血清总胆固醇、三酰甘油水平以及胆囊胆
汁胆固醇含量、胆固醇饱和指数均显著高于对照组（P<0.05）。高通量测序和生物信息学分析共筛选出1 334个 差异表达基因。KEGG 分析显示差异表达基因主要在脂类代谢、胆汁分泌、胰岛素分泌等通路富集。G0分析显示
脂肪酸代谢过程相关通路是显著富集的类型。肝脏转录组学分析和real-time PCR 均显示LD 组小鼠肝脏组织中胆
汁酸合成相关基因CYP7A1、CYP8B1、CYP7B1表达显著低于对照组（P<0.05）。结论：胆囊胆固醇结石小鼠存在 显著胆固醇、胆汁酸和脂肪酸代谢紊乱。转录组学研究可筛选出胆固醇结石形成过程中发挥作用的差异表达基 因，为相关研究提供参考。
关键词 胆结石；胆固醇结石；小鼠，近交C57BL ；胆汁酸类和盐类；转录组学
Charecteristic Analysit and Heyatic Trenscrietomict of High-fat Diet-inducef Cholesterol Gallstone Modef ie Mice
ZHUANG Qian , DONG ZOixia , YE Xia, CHENG Jinnian , WAN XiryUn DigePiee Entfcfic Center , Shanghai Jao Tong UniversPa AfftCateP Sixth People ，s Hospitnl , SOangOni (200233)
Coirespondencc to ： WAN Xinjian, Email ： slwadxmjian2022@126. com
Background : The moose moSei of high-fat diet-induceP cholestebS gallstone is widety useP in researches of
pathopenesis , prevention and treatment of gallstoneso Aimt ： To investiaate the characteristics and hepaUc manscbptomics of the moose moPvi of high-fat diet-induceP c holestevS callstonVi
Methodt : Twenty male C57BL/CJ mice were randomS
aLocated into chow diet ( controlS crosp and lithopenio diet ( LD) crosp. Aftec 8 weePs , the occhrrence of callstone was observeX ； the serum lipids and caUbUUder bile lipiPs were detected ； and the differenUally expresseP hepatic cenes betmeen
the two crosps were identifies with Illumina NovaLep sepuencina systems. The enrichment analysis was mappeX in G0 and
KEGG pathway dataLases. Real-time PCR was useP to detect the expressions of cenes relateX to bile acid synthesis in the live-.
Resplts : The c holestebS gallstone formation rate was 100% in LD crosp , whereas oc gallstone was observeX in
contaS grosp. Hepammeaaly and steatosis were obvioss in mice of LD grosp. The serum levels of W w I cholesteaP and
triacylglycerol , as weS as the cholesteaP contest and cholesteab saturation indec of the gaUVaUdvc bile in LD grosp were sianificantW highec than those in contaS grosp (P <0. 25). A total of 1 330 dimeresUally expresseP genes were identifies
by high-throsehput sepuencina and bioinformatics analysis. KEGG analysis sPoweP that the dimeresUally expresseP genes were mainly enricheP in lipid metaLoPsm, bile secretion , and insulin secretion pathways. G0 analysis sPoweP that fatty
acid memLolic process-relateP pathways were sianificantW enricheP. Both hepatic Wanscriptomics analysis and 1x 021117
PCR sPoweP that the expression levels of genes relateX to bile acid synthesis , micluclino CYP7A1, CYP8B1 and CYP7B1 decreaseP significantly in the live- of LD grosp as compareP with those of control grosp (P <0. 05 ). Conclusions ：
The
-582-Chin J GasWoexWrcC,ZOZO,Vol.25,No.10
mewLolism of cholesterol,bile acids and fatty acids is sianificantW disordereP in mice with cholesterol
Transcriptomics analysis can screes ost t he expresseP genes that play roles in the formation of cholesterol gallstone,sc as to provide references doc stuPivs fochsina on these topics.
Key wordt Cholelithiasis；Cholesterol Stones；Mice ,IndreP C57BL；Bile Acids and Salts；Transcriptomics
胆结石是一种常见的消化系统疾病，欧洲等发达国家和地区患病率高达22%［1］，我国报道的患病率为7%~10%J］，且因人口老龄化、饮食西方化等因素的影响，近年我国胆结石发病率呈明显上升趋势。根据所含胆固醇比例不同，胆囊结石可分为胆固醇结石、胆素结石和混合性结石，我国以胆固醇结石最为常见J］。在胆囊胆固醇结石的成因及其防治研究中，高脂饮食诱导的小鼠胆囊胆固醇结石模型是常用动物模型之一，造模方法为喂饲C57BL/C小鼠4~8周的高胆固醇、高胆酸、高脂肪饲料，成石率可达100%［49］，模型动物可出现与胆囊结石患者相似的病理生理学变化。尽管目前对胆囊胆固醇结石发生的病理生理学过程已有较深入的认识，如肠肝循环胆固醇-胆汁酸代谢异常、胆汁胆固醇过饱和等［69］，但对胆囊胆固醇结石形成的详细机制尚不完全清楚。因此，本研究成功建立了高脂饮食/J、鼠胆囊胆固醇结石模型，并进行模型特征和肝脏转录组学分析，以期为胆固醇结石的成因研究以及寻潜在的防治靶点提供参考0
材料与方法
一、实验动物和主要试剂
SPF级健康雄性C57BL/CJ小鼠22只,6周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司［许可证号：SCX
K（沪）20189006］，饲养于上海交通大学附属第六人民医院实验动物中心SPF级屏障环境中。成石饲料（含15%脂肪+1.25%胆固醇+6.2%胆酸）、普通饲料（含0.02%胆固醇；南通特洛菲饲料科技有限公司）。总胆固醇测定试剂盒、总胆汁酸试剂盒、三酰甘油测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high dessity lipoproteid cholesterol,HDL必）测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low dessity lipoproteid cholesterol:LDL-7）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；磷脂测定试剂盒（富士胶片和光纯药株式会社）；Tbzot总RNA抽提试剂（上海碧云天生物技术有限公司）；逆转录试剂盒（Hidcbpt®皿RT SuperMia foa qPCR）、real-time PCR试剂盒（AceQ®Universal SYBR qPCR Mastac Mix；南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。
二、方法
3.动物模型建立：实验小鼠经1周普通饲料适应性喂养后随机分为2组，每组10只，分别予普通饲料喂养（对照组）和成石饲料喂养［成石饮食（lithogeslc diet,LD）组］。环境条件：12h光照和1h黑暗交替，温度21~25七。实验期间小鼠自由饮水和进食，每周记录体质量。实验方案通过上海交通大学附属第六人民医院动物福利伦理委员会审核批准。
2-组织标本米集：喂养8周后，所有小鼠隔夜禁食12h，称重并编号；腹腔注射钠溶液（40mg/Cg）麻醉，摘取眼球留取全血，冰上静置后3000r/mid离心10mid，收集上层血清，-80°C保存
备用。颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，观察并记录胆囊胆固醇结石形成情况。完整剥离胆囊，称重，以密度为1g/mm9近似计算胆囊体积［9］，留取胆囊胆汁待测。肝脏和胆囊以4%多聚甲醛固定或液氮速冻后-80C保存备用。
3-血脂和胆囊胆汁脂质检测：吸取血清，采用总胆固醇、三酰甘油、HDL必、LDL-7测定试剂盒进行检测；吸取混匀的胆囊胆汁，采用总胆固醇、总胆汁酸、磷脂测定试剂盒进行检测。操作均严格按试剂盒说明书进行。分别计算胆汁中胆固醇、胆汁酸和磷脂摩尔浓度占三者摩尔浓度之和（即胆汁总脂质摩尔浓度）的百分比，根据Carey表计算胆汁胆固醇饱和指数［10］0
4-肝脏和胆囊组织学检查：肝脏、胆囊组织4%多聚甲醛固定、脱水、透明、包埋、切片，常规行HE 染，肝脏组织另行油红染，光学显微镜下观察组织病理学改变。使用Image-Pro Plus软件（v6.0）分析油红染切片中红脂滴面积占整个视野面积的百分，染定。
5.Illumina高通量测序和分析：由北京贝瑞和康生物技术有限公司进行小鼠肝脏组织RNA提取和检测、文库构建、文库质检和上机测序，并进行数据质控和基因表达分析。
胃肠病学2525年第25卷第1期-583-
①建库测序：每组取5只小鼠的肝脏组织提取RNA并检测，浓度和总量达标进行文库构建。以磁珠富集
真核生物mRNA，将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板依次合成cDNA第一链和第二链；继而对双链cDNA进行3'-末端腺昔酸化，再连接测序接头，最后进行PCR扩增富集cDNA。文库构建完成后进行文库质检，合格后通过Dlumina NovaSeq测序平台进行高通量测序。
②生物信息学分析：对测序得到的原始序列进行过滤，得到干净、有效、高质量的clexd reads。应用Hisat2软件（v2.0.6）将由测序数据得到的reads 比对参考基因组，进而对转录本进行注释和定量0应用edgeR软件（v3.3.3）分析基因在各样本中的差异表达情况，并进行多重假设检验校正，得到校准后P值。以校准后P值<0.05且差异表达倍数>2为标准筛选差异表达基因。应用R语言（v4.0.2）绘制展现差异表达结果的火山图和热图。
基因本体论数据库（Gesa Ontology,G0; //j可对基因和蛋白功能进行限定和描述。从生物过程（biologichi precess）、细胞组分（cellulac01110006x1-和分子功能（molecular functios）三个层面对差异表达基因进行GO富集分析，确定差异表达基因的主要生物学功能。同理，应用京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto EncyclobeSip of Gesas and Gesomas,KEGG; https：///ww.kegg.jp/）对各个信号通路中的差异表基因和KEGG分。本研究使用cluster/rofilac软件（v3.16.1）进行差异表达基因的G0和KEGG富集分析0
6-Real-time PCR验证肝脏胆汁酸合成相关基因表达：以Tbzol试剂提取肝脏组织总RNA，逆转录合成cD
NA，根据试剂说明书配置PCR反应体系，检测胆固醇7a-必化酶（cholesterol7a-hydroxylase, CYP7A1）、微粒体e醇12a-必化酶（sterol12—hydroxylase,CYP8B1）、氧笛醇7a-必化酶（oxysterol 7a-hydroxylase,CYP7B1）、笛醇27a-必化酶（sterol 27a-hydroxylase,CYP27A1）表达。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）0PCR 反应条件：95C10s,66C39s，共44个循环。采用2-曲法计算目的基因mRNA相对表达量0
三、统计学分析
应用R语言进行统计学分析。计量资料以t±
表1肝脏胆汁酸合成相关基因PCR引物序列
基因引物序列
CYP7A1F5'-AGC AGC CTC TGA AGA AGT GAA TGG-3'
R5'-AGA GCC GCA GAG CCT CCT TG-3'
CYPBl F5'-ACA CCA AGG ACA AGC AGC AAG ACt'
R5'-PGG CTC ACT TCC ACC CAC TCCt'
CYP7B2F5'-GGA GCC ACG ACC CTA GAT Gt'
R5'-PGC CAA GAT AAG GAA GCC AACt'
image pro plusCYP57A3F5'-ACA CGG ATG CCT TAA ACG AGGt'
R5'-GCA GCC AAT CCT TTT CTC AAA Ct' GAPDH（内参）F5'-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3'
R5'-PGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3'
c表示，两组间比较采用两独立样本i检验或Manv Whitney U检验；两组间不同时间点体质量整体差异的比较采用两因素重复测量方差分析。P<6.07为异统学。
结果
一、小鼠一般情况和胆囊胆固醇结石形成率
喂养8周后，对照组小鼠胆囊中未见结石，胆汁澄清透亮;LD组小鼠胆囊中可见鹅卵石样或不规则形态结石形成，胆汁混浊，可见大量胆固醇结晶（图1A），成石率为100%。两组小鼠造模期间体质量无明显
差异（P=6.447；图1B）；LD组胆囊体积大于对照组，差异有统计学意义（Pv。..；图1C）；两组肝质量/体质量比分别为9.97%±6.07%和4.87%±6.23%,LD组明显大于对照组，差异有统计学意义（Pv。..；图1D），表明成石饲料可致小鼠肝脏体积大。
二、小鼠血脂、胆囊胆汁脂质成分和肝脏、胆囊
学
与对照组相比丄D组力、鼠血清总胆固醇、三酰甘油、LDL3水平明显升高,HDL3水平明显降低，差异均有统计学意义（P<0.01,P<0.01,P< Hl,P=6.02；图2A）。
LD组小鼠胆囊胆汁内胆固醇占总脂质的百分比高于对照组，胆汁酸占总脂质的百分比低于对照组，差异均有统计学意义（Pv...,P=0.03；图2B）；胆固醇占比升高、胆汁酸占比降低，导致胆汁胆固醇饱和指数增加，差异有统计学意义（P< Hl；图2C）。
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Chic J Gastaechai, 2222 , Vol. 25 , No. 19
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"两组间比较,Pv/.l
图1对照组与LD 组小鼠胆囊胆固醇结石形成、胆囊体积和肝质量/体质量比
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两组间比较,* P</.25 , " Pv/.l
图2对照组与LD 组小鼠血脂、胆囊胆汁脂质成分和
胆固醇 和
鼠肝脏 HE 染细胞结构清晰,
未见明显病变丄D 组则可见大 性 ，提
示肝脏 性（图3A ）；油红染LD. 滴
积占视野面积百分 于 ，差异有统计学
意义（P</.2I ；图3B ），提示肝脏脂质沉积。
-
照组相比,LD 组小鼠胆
明 厚（图3C ）o
体质量、
A
对照
LD
"两组间比较,Pv/.l
A ：肝脏HE 染（X15/）；
B ：肝脏油红染（x30/）；
C ：胆囊 HE 染（完整视图，X56；局部放大视图，X21）
图3对照组与LD 组小鼠肝脏、胆囊HE 染和肝脏油红
染比较
三、肝脏差异表达基因筛选
以P</.25和差异表达倍数>2为标准，共筛 选出I 333个LD 组肝脏 相对于
的差异
表达基因，其中上调基因42。个，下调基因419个,
据此绘制火山图（图4A ），热图展示 异表 ：
显著的前56个基因（图4B ）。
、差异表达基因KEGG 富集分析和GO 功能
富集分
选出的差异表达基因 KEGG
分
胃肠病学鸟/鸟/年第25卷第3期-585-
析，结果显示差异表达基因在19条通路显
(图5A)，主要于代谢、胆汁分泌、素分通路。GO功能注释、富集分示，在生物过程分组，脂肪酸代谢过程相关通路是的型；在细胞组分分组，细胞物质转运相关的细胞组分是的类型；在分子功能分组, e体轻化酶活性、离子跨运活性等相关通路是显著富集的类型(图5B)。
,Real-time PCR验证肝脏胆汁酸合成相关基因表
肝脏组织中胆汁酸合成相关基因CYP7AI、CYP8BI和CYP7BI在LD组的相对表达量均低于对照组，差异有统计学(P二/./,P v/.I, </.2I)，两组间CYP27AI表达差异无统计学意义(P>/.25;106)。上述基因表达情况的real-time PCR验肝脏学分一致。
讨论
点认为，胆汁胆固醇过饱和是胆固醇结的首要 ⑷。本发现，经8，石饲料后，小鼠胆囊胆胆固醇含量明力廿。
肠是胆固醇吸收的主要场所，料中的胆酸可促肠胆固醇吸收⑸。过量的胆固醇吸收使小鼠血清总胆固醇以及其他脂质含量明显增加。此外，料的小鼠还表现为肝大和显的肝脏性，肝脏分胆汁的胆固醇增多，最终导致胆汁胆固醇含力□，促进胆汁胆固醇过和发和。料含15%的脂肪，但本LD鼠造模过体质量的变化相比并无明显差异。既：发现，饮食中额加。”％胆酸可在鼠进食量的抑制和
饮食诱导的体质力卩，其机制可能与胆酸与G蛋白耦联胆汁酸受体I(G pateic-coonleP bite acif receptoo I,GPBARI/结合，进而通过环腺昔酸(AMP)介导甲状腺活、增加能量注
[I1D4]o因此，添加胆酸是胆固醇型多其他饮食模型的重要不同之处，在参考其他无胆酸饮食模型的时，应胆酸存在，何种。
是指特定细胞在某一发育阶段或功能状态出的RNA的总和，红学能从整体基因功能，筛选出差异表达基因，为在分致病基因极大的便利[3]o本研究通过Tlumina Novabep测序平台对鼠肝脏RNA通量测序和生物信息学分析，料诱导小鼠胆囊胆固醇•形
A
log2差异倍数43512图4LD组小鼠肝脏组织差异表达基因火山图(A)和热图
(B)
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