髓样分化蛋白２基因沉默对高糖诱导的大鼠心肌细胞增殖抑制、
凋亡及炎症反应的影响
林中民１，陈国荣１，张泉波１，王　芳１，项兰婷１，曹琼洁２△
（１．温州医科大学附属第一医院病理科，２．温州医科大学附属眼视光医院省部共建眼视光学和
视觉科学国家重点实验室，浙江温州３２５０００）
【摘要】　目的：研究髓样分化蛋白２（ＭＤ２）基因沉默对高糖（ＨＧ）诱导的大鼠心肌细胞增殖抑制、凋亡及炎症反应的影响及其机制。方法：体外大鼠心肌细胞系Ｈ９Ｃ２细胞随机分为４组（ｎ＝３）：ＬＧ组、ＨＧ组、ＨＧ＋ＮＣ组、ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２组，分别转染ＭＤ２基因小干扰ＲＮＡ（ｓｉ ＭＤ２）或阴性对照２４ｈ后进行低糖或高糖处理４８ｈ。ＲＴ ｑＰＣＲ检测ＭＤ２及细胞内炎症细胞因子ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６的表达水平，ＭＴＳ法、流式细胞术检测细胞增殖能力、细胞周期和细胞凋亡率，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测细胞内相关蛋白的表达水平及磷酸化水平。结果：转染ｓｉ ＭＤ２后，Ｈ９Ｃ２细胞中ＭＤ２的表达水平明显下降（Ｐ＜０．０１）。与低糖（ＬＧ）组比较，高糖处理后的Ｈ９Ｃ２细胞中ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６的ｍＲＮＡ水平显著升高，细胞增殖能力下降并发生Ｇ１期阻滞，细胞凋亡率和ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ ３蛋白水平升高（Ｐ＜０．０
１）。而ＭＤ２基因沉默可拮抗高糖对Ｈ９Ｃ２细胞增殖、细胞周期、凋亡及细胞中ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６ｍＲＮＡ水平的影响（Ｐ＜０．０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定结果表明高糖处理后的Ｈ９Ｃ２细胞中细胞外信号调节激酶（ＥＲＫ１／２）、Ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（Ｐ３８ＭＡＰＫ）和Ｃ Ｊｕｎ氨基末端激酶（ＪＮＫ）蛋白的磷酸化水平明显升高，而ＭＤ２基因沉默可抑制高糖诱导下的ＥＲＫ１／２、Ｐ３８ＭＡＰＫ和ＪＮＫ蛋白激活（Ｐ＜０．０１）。结论：ＭＤ２基因沉默可能通过抑制ＥＲＫ、Ｐ３８ＭＡＰＫ和ＪＮＫ信号通路的激活来减少高糖诱导的大鼠心肌细胞炎症细胞因子表达，减少心肌细胞凋亡，促进细胞增殖。
【关键词】髓样分化蛋白２；大鼠心肌细胞；炎症因子；细胞凋亡；增殖
【中图分类号】Ｒ５８７．２，Ｒ３６３    【文献标识码】Ａ    【文章编号】１０００ ６８３４（２０１９）０３ ２７３ ００７
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５８３４．２０１９．０５７
ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｎｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｒａｔｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ
ＬＩＮＺｈｏｎｇ ｍｉｎ１，ＣＨＥＮＧｕｏ ｒｏｎｇ１，ＺＨＡＮＧＱｕａｎ ｂｏ１，ＷＡＮＧＦａｎｇ１，ＸＩＡＮＧＬａｎ ｔｉｎｇ１，ＣＡＯＱｉｏｎｇ ｊｉｅ２△（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＷｅｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，ＯｐｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＶｉｓｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅ，ＥｙｅＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＷｅｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｎｚｈｏｕ３２５０００，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２（ＭＤ２）ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｎｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏ ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｒａｔｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄｒａｔｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｃｅｌｌｌｉｎｅＨ９Ｃ２ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＭＤ２ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ（ｓｉ ＭＤ２）ａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｆｏｒ２４ｈ，ｔｈｅｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ（ＨＧ）ｆｏｒ４８ｈ．ＲＴ ｑＰＣＲｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆＭＤ２ａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓ
ＴＮＦ α，ＩＬ １βａｎｄＩＬ ６．ＭＴＳａｎｄｆｌｏｗｃｙ ｔｏｍｅｔｒｙｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭＤ２ｉｎＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｉ ＭＤ２（Ｐ＜０．０１）．Ａｆｔｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ，ｔｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｉｎＧ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ，ｔｈｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｏｆｃｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ ３ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗａｓｄｅ ｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１）．ＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇａｎｔａｇｏｎｉｚｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｏｎｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ，ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆＴＮＦ α，ＩＬ １β，ＩＬ ６（Ｐ＜０．０５）．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ１／２），Ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（Ｐ
３８ＭＡＰＫ）ａｎｄＣ ＪｕｎＮ ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）ｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｉｎ ｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｒｅｖｅｒｓｅｄｂｙｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆＭＤ２（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｔｈａｔＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｒｅｖｅｒｓｅｓｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎ ｈｉｂｉｔｉｏｎｖｉａｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｖｏｌｖｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＲＫ，Ｐ３８ＭＡＰＫ，ＪＮＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】　ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ２；　ｒａｔｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｃｅｌｌ；　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ；　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
  【基金项目】温州市科技计划项目（Ｙ２０１７００５３）；温州市重大科技创新攻关项目（２０１８ＺＹ０１９）
【收稿日期】２０１９ ０２ ２８【修回日期】２０１９ ０４ ２９
　△【通讯作者】Ｔｅｌ：０５７７ ８８０６７９３４；Ｅ ｍａｉｌ：ｖｉｃｋｙ．ｃｑｊ＠１６３．
ｃｏｍ  糖尿病心肌病（ｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ，ＤＣＭ）是糖尿病患者的主要心血管并发症之一［１］，临床上主要依靠控制血糖、降血压来控制糖尿病心肌病病
３
７
２
中国应用生理学杂志，２０１９，３５（３）
程，作用有限。近年来越来越多的证据显示炎症可能单独或作为高血糖的下游环节在糖尿病心肌病的发病机制中起关键作用［２，３］。ＭＤ２是Ｔｏｌｌ样受体４（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４，ＴＬＲ４）的辅助蛋白，是ＬＰＳ ＴＬＲ４炎症反应的直接介导物。ＴＬＲ４／ＭＤ２ ＬＰＳ形成三元复合物激活下游信号通路：ＭＡＰＫｓ／ＮＦ κＢ炎症因子转录途径和干扰素 β（ＩＦＮ β）转录途径［４］，调控下游炎症因子、趋化因子和黏附分子等的转录和表达［５］。ＭＤ２还可以结合其他内源性配体，如ＨＭＧＢ１［６］，ＳＡＡ３［７］和胆固醇［８］，以激活ＴＬＲ４促炎信号通路，在多种慢性炎症疾病发生发展过程中也起重要作用，如糖尿病并发症、肥胖和动脉粥样硬化等［９ １１］。ＭＤ２在心肌炎症反应中的作用未见报道，但慢性炎症作为应答组织或胞内应激损伤的常见病
理反应，在不同器官或组织的免疫防御机制是相通的。今后，阻断炎症反应相关靶点，如靶向基因沉默等方法有望成为ＤＣＭ或联合的重要策略。所以我们提出假设ＭＤ２基因沉默能干扰高糖／高血糖诱导的心肌炎症反应，对ＤＣＭ发生发展起重要作用。
本课题旨在体外培养大鼠心肌细胞系Ｈ９Ｃ２来明确高糖对细胞的损伤，进一步研究ＭＤ２基因沉默对高糖处理后的大鼠心肌细胞增殖、凋亡及炎症因子水平的影响，并初步探讨其可能机制，或能为糖尿病心肌病提供新的思考和方案。
１　材料与方法
１．１　材料与设备
大鼠心肌细胞系Ｈ９Ｃ２购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（上海）。ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清ＦＢＳ、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ、Ｌｉｐｏ ｆｅｃｔａｍｉ ｎｅＴＭＲＮＡｉＭＡＸ转染试剂、Ｔｒｉｚｏｌ试剂、ｐｏｗｅｒｕｐＴＭ ＳＹＢＲｇｒｅｅｎｍａｓｔｅｒｍｉｘ均购自美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司；Ｄ 葡萄糖和Ｄ 甘露醇购自美国Ｓｉｇ ｍａ公司；ｓｉＲＮＡ由中国广州锐博生物科技有限公司合成；Ｍ ＭＬＶ逆转录试剂盒、细胞增殖实验（ＭＴＳ法）试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；一抗抗体均购于美国ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｇｙ公司；硝酸纤维素膜购于德国ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；Ｃｙｃｌｅｔ
ｅｓｔＰｌｕｓＤＮＡＲｅａ ｇｅｎｔ试剂盒、ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ细胞凋亡检测试剂盒均购自美国ＢＤ公司；７５００型荧光实时定量ＰＣＲ仪购自美国ＡＢＩ公司；流式细胞仪购于美国ＢＤ公司；Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００倒置相差荧光显微镜购自德国ＣａｒｌＺｅｉｓｓ公司。１．２　细胞培养
Ｈ９Ｃ２细胞培养于含１０％ＦＢＳ、１×１０５Ｕ／Ｌ青霉素和１００ｍｇ／Ｌ链霉素的低糖（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）ＤＭＥＭ培养基中，于３７℃、５％ＣＯ
２
培养箱中培养，待细胞接近８０％融合时用０．０５％胰蛋白酶消化传代。倒置相差荧光显微镜下观察细胞及图像记录。１．３　脂质体转染小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
将对数生长期的Ｈ９Ｃ２接种于多孔培养板，用阳离子脂质体介导的方法将终浓度为５０ｎｍｏｌ／Ｌ的ＭＤ２基因小干扰ＲＮＡ（ｓｉ ＭＤ２）按组别转染入细胞，以相同方法转染一段长度和结构都与ｓｉＲＮＡ类似的随机序列寡核苷酸双链作为阴性对照（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ，ＮＣ）。具体转染步骤根据ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＲＮＡｉＭＡＸ转染说明书。ｓｉ ＭＤ２序列：５’ ＣＣＡＡＴ ＧＧＡＴＴＴＧＴＧＣＡＴＧＴＴＴ ３’和５’ ＡＣＡＴＧＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＧＴＴ ３’。
１．４　实验分组
实验共分为４组，ＬＧ组：３３ｍｍｏｌ／Ｌ甘露醇；ＨＧ组：３３ｍｍｏｌ／ＬＤ 葡萄糖；ＨＧ＋ＮＣ组：５０ｎｍｏｌ／ＬＮＣ＋３３ｍｍｏｌ／ＬＤ 葡萄糖；ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２组：５０ｎｍｏｌ／Ｌｓｉ ＭＤ２＋３３ｍｍｏｌ／ＬＤ 葡萄糖。Ｈ９Ｃ２细胞按１．３方法转染ｓｉＲＮＡ２４ｈ后，加入终浓度为３３ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｄ 葡萄糖刺激４８ｈ，对照组加入３３ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｄ 甘露醇用于排除渗透压作用干扰。
１．５　细胞ＲＮＡ提取及ＲＴ ｑＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ试剂法分别提取４组细胞的总ＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ后进行ＲＴ ｑＰＣＲ检测各细胞中ＭＤ２、肿瘤坏死因子α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａ，ＴＮＦ α）、白介素１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１β，ＩＬ １β）、白介素６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６，ＩＬ ６）的ｍＲＮＡ水平。以ＧＡＰＤＨ为内参，用２ ΔΔＣｔ法分析目的基因相对表达量，计算公式为：ΔＣｔ＝Ｃｔ目的基因 Ｃｔ内参，ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ实验组 ΔＣｔ对照组，相对表达量＝２ ΔΔＣｔ。内参ＧＡＰＤＨ的上游引物为５＇ＴＡＴＧＡＣＴＣＴＡＣＣＣＡＣＧ ＧＣＡＡＧ３＇，下游引物为５＇ＡＴＡＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＴ ＣＡＣＣ３＇；ＭＤ２的上游引物为５＇ＴＡＴＴＴＡＣＴ ＧＡＡＴＣＴＧＡＧＡＧＧＣ３＇，下游引物为５＇ＧＡＡＴＧＡＡＣＴ ＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣ３＇；ＴＮ
Ｆ α的上游引物为５＇ＴＡＣＴＣ ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧ３＇，下游引物为５＇ＣＴＣ ＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＧ３＇；ＩＬ １β的上游引物为５＇ＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧ３＇，下游引物为５＇ＧＧＧＴＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＡＣ３＇；ＩＬ ６的上游引物为５＇ＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＴＴＴＣＴＡＣＣＴＧ３＇，下游引物为５＇ＣＴＴＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＧＡ３＇。ＲＴ ＰＣＲ扩增条件
４
７
２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１９，３５（３）
为：９５℃预变性１０ｍｉｎ；９５℃变性１５ｓ，６０℃退火延伸６０ｓ，共４０个循环，反应体系为２０μｌ。
１．６　细胞增殖实验
对数生长期的Ｈ９Ｃ２细胞以３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ均匀接种到９６孔板中，每组设６个复孔。按上述方法处理细胞４８ｈ后，弃去培养基，于每孔中加入８５μｌ无血清Ｆ１２培养液和１５μｌＭＴＳ混合液，于３７℃孵育２ｈ后，用酶标仪在４９０ｎｍ波长下读取吸光度（Ａ），计算相对细胞
数目＝实验组Ａ值／对照组Ａ值×１００％。
１．７　流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡
将上述４个组别的细胞用０．０５％胰蛋白酶消化并收集，按ＣｙｃｌｅｔｅｓｔＰｌｕｓＤＮＡＲｅａｇｅｎｔ试剂盒和ＡｎｎｅｘｉｎⅤ ＦＩＴＣ细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，然后用流式细胞仪检测细胞周期变化情况及细胞凋亡水平，右上与右下两个象限百分率之和即是细胞凋亡率。
１．８　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测细胞内相关蛋白的表达情况
将上述４个组别的细胞用ＲＩＰＡ裂解液裂解，提取各组细胞的总蛋白。蛋白经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，经５％脱脂奶粉 ＰＢＳＴ封闭液封闭３ｈ后，按１∶１０００稀释一抗抗体，于４℃孵育过夜，经ＰＢＳ洗脱后再用１∶５０００的带有荧光基团标记的二抗室温孵育２ｈ，最后在ＯｄｙｓｓｅｙＬｉｃｏｒ双红外激光成像仪上进行曝光成像，然后通过ｉｍａｇｅｐｒｏｐｌｕｓ软件计算灰度值，计算目的蛋白的相对表达量＝目的蛋白的灰度值／内参ＧＡＰＤＨ的灰度值。
１．９　统计学处理
实验重复３次，数据以均值±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７软件进行统
计学分析。组间比较采用独立样本ｔ检验。
２　结果
２．１　ｓｉＲＮＡ转染后细胞中ＭＤ２水平的变化为了研究ＭＤ２基因沉默对高糖处理后的心肌细胞的影响，我们设计了ＭＤ２的ｓｉＲＮＡ用于转染细胞以求达到基因沉默的目的。结果如图１和表１所示，转染ｓｉ ＭＤ２后，细胞中ＭＤ２ｍＲＮＡ和蛋白水平均显著下降（Ｐ＜０．０１），说明通过小ＲＮＡ干扰技术达到ＭＤ２
基因沉默的效果。Ｆｉｇ．１　ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭＤ２ｉｎｔｈｅＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｔｅｓｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
Ｍｏｃｋ：Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ｓｉ ＭＤ２：ＭＤ２ｓｉＲＮＡ
Ｔａｂ．１　ＴｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭＤ２ｉｎｔｈｅＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｓｉＲＮＡ（珋ｘ±ｓ，ｎ
＝３）
ＧｒｏｕｐｍＲＮＡｌｅｖｅｌＰｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ
Ｍｏｃｋ１．０１±０．０１０．５９±０．０３
ＮＣ０．９７±０．１１０．５０±０．０３
ｓｉ ＭＤ２０．３２±０．０４  ０．０８±０．０１
  Ｍｏｃｋ：Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ｓｉ ＭＤ２：ＭＤ２ｓｉＲＮＡ
    Ｐ＜０．０１ｖｓＮＣｇｒｏｕｐ
２．２　ＭＤ２基因沉默对高糖处理后炎症因子ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６的表达的影响
ＲＴ ｑＰＣＲ检测４组Ｈ９Ｃ２细胞内炎症因子ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６的表达水平。ＨＧ组ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６的ｍＲＮＡ相对水平与ＬＧ组相比显著升高（Ｐ＜０．０１）；相较ＨＧ＋ＮＣ组，ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２组的ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６ｍＲＮＡ相对水平显著下调（Ｐ＜０．０５，表２）。
Ｔａｂ．２　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓＴＮＦ α，ＩＬ １β，ａｎｄＩＬ ６ｏｆ
Ｈ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
ＧｒｏｕｐＴＮＦ αＩＬ １βＩＬ ６
ＬＧ１．０４±０．０３１．０５±０．０６１．０２±０．０２
ＨＧ２．３８±０．４８  ３．５６±０．４５  ２．１９±０．１０
ＨＧ＋ＮＣ２．８８±０．８４４．０５±０．２９２．３６±０．２２
ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２１．２０±０．０６＃１．４８±０．１３＃＃１．３２±０．０９＃＃
image pro plus  ＴＮＦ α：Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａ；ＩＬ １β：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１β；ＩＬ ６：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６
    Ｐ＜０．０１ｖｓＬＧｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓＨＧ＋ＮＣｇｒｏｕｐ
２．３　ＭＤ２基因沉默对高糖处理后的心肌细胞增殖能力的影响
ＭＴＳ实验结果显示ＨＧ组的相对细胞数目为（８５．１９±０．６５）％，与ＬＧ组（１００％）相比明显减少（Ｐ＜０．０１）；而ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２组的相对细胞数目为（９４．７３±１．２２）％，显著高于ＨＧ＋ＮＣ组的（８０．８９±０．７４）％（Ｐ＜０．０１）。结合显微镜对细胞状态的图像记录（图２）可以看出，高糖处理抑制心肌细胞的增殖，而ＭＤ２基因沉默可以促进高糖处理后的心肌细胞增殖。
５
７
２
中国应用生理学杂志，２０１９，３５（３）
Ｆｉｇ．２　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ．Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓｏｆｃｅｌｌｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ４８ｈｗｅｒｅｔａｋｅｎｂｙｏｐｔｉｃａｌｍｉ ｃｒｏｓｃｏｐｅ（ｕｎｃｏｌｏｒｅｄ×２００）
ＬＧ：Ｌｏｗｇｌｕｃｏｓｅ；ＨＧ：Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎ ｔｒｏｌ；ｓｉ ＭＤ２：ＭＤ２ｓｉＲＮＡ
２．４　ＭＤ２基因沉默对高糖处理后的心肌细胞细胞周期的影响
流式细胞术结果显示，ＨＧ组细胞滞留在Ｇ０／Ｇ１的细胞数（５４．９６±０．３７）％较ＬＧ组（４１．７３±０．６１）％明显增多，而Ｓ期细胞从ＬＧ组的（４６．５７±０．９４）％减少到（３１．６０±１．１３）％（Ｐ＜０．０１）。ＭＤ２基因沉默后，ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２组滞留在Ｇ０／Ｇ１的细胞数为（４５．１４±１．５９）％，显著少于ＨＧ＋ＮＣ组的（５４．４２±１．３１）％（Ｐ＜０．０１），而Ｓ期细胞从ＨＧ＋ＮＣ组的（３２．４４±１．０７）％增多到（３９．７１±１．１２）％（Ｐ＜０．０１，图３）。
Ｆｉｇ．３　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｎｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｏｆＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ．Ｔｈｅｍｏｓｔｒ
ｅｐｒｅｓｅｎｔａ ｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓａｒｅｄｅｐｉｃｔｅｄ
ＬＧ：Ｌｏｗｇｌｕｃｏｓｅ；ＨＧ：Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎ ｔｒｏｌ；ｓｉ ＭＤ２：ＭＤ２ｓｉＲＮＡ２．５　ＭＤ２基因沉默对高糖处理后的心肌细胞凋亡率的影响
流式细胞术分析发现ＨＧ组的细胞凋亡率为（８．３０±０．２５）％，显著高于ＬＧ组的（３．８６±０．３６）％（Ｐ＜０．０１）；与ＨＧ＋ＮＣ组的（７．６５±１．０４）％相比，ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２组的细胞凋亡率为（５．７８±０．２２）％，显著下降（Ｐ＜０．０１，图４）。结果说明高糖诱导心肌细胞凋亡，而ＭＤ２基因沉默可以减少高糖诱导的心肌
细胞凋亡。
Ｆｉｇ．４　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｎｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅｏｆＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ．Ｔｈｅｍｏｓｔｒｅｐｒｅ ｓｅｎｔａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓａｒｅｄｅ ｐｉｃｔｅｄ
ＬＧ：Ｌｏｗｇｌｕｃｏｓｅ；ＨＧ：Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎ ｔｒｏｌ；ｓｉ ＭＤ２：ＭＤ２ｓｉＲＮＡ
２．６　ＭＤ２基因沉默对高糖处理后心肌细胞中ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ ３蛋白水平的影响
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验结果显示高糖处理的心肌细胞中凋亡信号分子ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ ３蛋白相对表达量为（０．１１９±０．００４），较低糖组的（０．０５±０．００７）显著升高（Ｐ＜０．０１）；与ＨＧ＋ＮＣ组的（０．１４１±０．００６）相比，ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２组的ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ ３蛋白相对表达量为（０．０９６±０．００６），显著下降（Ｐ＜０．０１，图５）。
２．７　ＭＤ２基因沉默对高糖处理后的ＥＲＫ１／２、Ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ蛋白磷酸化水平的影响
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验结果显示：与ＬＧ组相比，ＨＧ组细胞中ＥＲＫ１／２、Ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ蛋白的磷酸化水平明显升高（Ｐ＜０．０１）；而ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２组细胞中ＥＲＫ１／２、Ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ蛋白的磷酸化水平与ＨＧ＋ＮＣ组相比明显下降（Ｐ＜０．０１，图６，表３）。说明
６
７
２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１９，３５（３）
ＭＤ２基因沉默可以抑制高糖诱导的ＥＲＫ１／２、Ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ
蛋白磷酸化。
Ｆｉｇ．５　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｎＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ
３ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ
ＬＧ：Ｌｏｗｇｌｕｃｏｓｅ；ＨＧ：Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎ ｔｒｏｌ
；ｓｉ ＭＤ２：ＭＤ２ｓｉＲＮ
ＡＦｉｇ．６　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＭＤ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆ
ＥＲＫ１／２，Ｐ３８ＭＡＰＫａｎｄＪＮＫｐｒｏｔｅｉｎｏｆｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｄｕｃｅｄＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓ
ＬＧ：Ｌｏｗｇｌｕｃｏｓｅ；ＨＧ：Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎ ｔｒｏｌ；ｓｉ ＭＤ２：ＭＤ２ｓｉＲＮＡ
Ｔａｂ．３　Ｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆｐ ＥＲＫ１／２／
ＥＲＫ１／２，ｐ Ｐ３８／Ｐ３８，ｐ ＪＮＫ／ＪＮＫｉｎＨ９Ｃ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ（珋
ｘ±ｓ，ｎ＝３）Ｇｒｏｕｐ
ｐ ＥＲＫ１／２／ＥＲＫ１／２
ｐ Ｐ３８／Ｐ３８
ｐ ＪＮＫ／ＪＮＫ
ＬＧ０．３１±０．０２
０．６６±０．０２
０．１９±０．０１
ＨＧ０．９６±０．０４
０．９３±０．０３
１．０５±０．０３
ＨＧ＋ＮＣ１．０３±０．０１
０．９３±０．０２
０．８８±０．０６
ＨＧ＋ｓｉ ＭＤ２
０．５５±０．０２
＃＃
０．６１±０．０３
＃＃
０．２０±０．０１
＃＃
Ｐ＜０．０１ｖｓＬＧｇｒｏｕｐ；＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓＨＧ＋ＮＣｇｒｏｕｐ
３　讨论
糖尿病心肌病发病机理复杂，独立于高血压病、
冠状动脉疾病和其它已知重大心脏瓣膜疾病［１２］。
近些年研究发现，慢性炎症反应以炎症标志物升高为特征，成为糖尿病心肌病的重要病理因素之
一［１３］
。高糖能激活组织或胞内的损伤应激相关信
号通路，直接诱导心肌细胞中炎症因子、趋化因子和
黏附分子的分泌增加［１４］。因此阻断炎症反应及其
相关靶点有望成为今后ＤＣＭ的重要策略。已有研究显示汉黄芩素在Ｓ
ＴＺ糖尿病小鼠中表现出抗炎和抗氧化应激的特性，可以通过抑制炎症和氧
化应激来减轻高血糖诱导的心肌细胞损伤［１５］。Ｐａｎ
等人的研究发现抗炎化合物姜黄素［５］可以通过抑
制ＮＦ κＢ激活、减少炎症因子的产生而作为糖尿病心肌病的潜在剂。
ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６ 是机体炎症反应和免疫应答的重要炎症因子，能激活细胞内信号通路，引起细胞异常增殖、分化及合成多种炎症因子等一系列生理生化改变。本研究证实高糖处理４８ｈ的Ｈ９Ｃ２细胞内上述炎症因子表达上调，细胞增殖能力下降。细胞周期检测结果表明，高糖处理导致Ｈ９Ｃ
２细胞滞留在Ｇ０／Ｇ１期，这可能是Ｈ９Ｃ２细胞增殖受到抑制的原因之一。而ＭＤ２基因沉默显著抑制高糖刺激的Ｈ９Ｃ２细胞内ＴＮＦ α、ＩＬ １β、ＩＬ ６的表达，明显减少滞留在Ｇ０／Ｇ１期的细胞，促进高糖处理后的心肌细胞增殖。已有报道ＭＤ２小分子抑制剂可以阻断ＭＤ２与ＴＬＲ４的结合，显著减轻ＬＰＳ诱导的细胞
炎症反应［１６］。Ｗａｎｇ等人的工作发现饱和棕榈酸能
通过直接结合Ｔ
ＬＲ４辅助蛋白ＭＤ２诱导心肌炎性损伤［１７］。此外，Ｆａｎｇ等人的最新研究表明ＭＤ２通
过激活炎症途径中的ＪＮＫ／ＥＲＫ和ＮＦ κＢ炎症通路，在肥胖诱导的心脏肥大发挥至关重要的作
用［１８］
。我们推测ＭＤ２表达下调可抑制炎症信号通
路，减轻高糖所致的心肌细胞炎症损伤，使细胞活性得到明显提高，从而促进高糖处理后的心肌细胞增殖。
无论在糖尿病患者和糖尿病动物模型中，心肌
细胞凋亡都是持续高血糖的关键病理结果［１９］。细
胞凋亡是机体自身进行的一种程序性死亡，在多种心血管疾病发生发展过程中都伴有心肌细胞凋
亡［２０］。本研究发现ＭＤ２基因沉默可以减少高糖诱
导的心肌细胞凋亡，显著降低细胞中Ｃａｓｐａｓｅ ３活化水平。可能ＭＤ２基因沉默通过抑制Ｃａｓｐａｓｅ ３的活性，从而抑制高糖诱导的细胞凋亡。
丝裂原活化蛋白激酶ＭＡＰＫ信号通路是涉及了多级蛋白激酶的级联反应，参与了糖尿病心肌病
最重要的细胞损伤和炎症反应的病理过程［２１ ２３］。其家族成员Ｅ
ＲＫ１／２［２４，２５］，ＪＮＫ［２５］和ｐ３８ＭＡＰＫ［２６］
能够被多种胞外刺激激活，将信号从细胞膜表面受体转导至细胞核，调控着细胞周期、细胞增殖、细胞
７
７２中国应用生理学杂志，２０１９，３５（３）