心脏生物起搏器的应用进展
安徽省第二人民医院心内科  赵文强
随着人工心脏起搏器适应证范围的扩大，越来越多的患者受益于心脏起搏。 但是在临床应用过程中，仍有一些亟需解决的问题，如电池寿命问题、静脉血栓形成、环境强磁场干扰以及缺乏对神经递质的自动反应性等[1]。这些缺点使得人们迫切需要寻到更为理想的方法。随着细胞生物学技术的飞速发展，以及细胞电生理的深入研究，使细胞移植构建心脏生物起搏器成为可能。心脏生物起搏就是利用细胞分子生物学及其相关技术，对受损的自律性节律点或发生传导障碍的特殊传导系统的组织进行修复或替代，使心脏的起搏和传导功能得以恢复，主要方法包括基因转染、细胞移植和激素3 种方法。文章总结现有方法各自存在的优势和不足，综述如下。
一、 基因
基因是应用基因工程技术将功能正常的目的基因转移到受损的自律性节律点或特殊传导系统的组织中，通过导入起搏基因的表达补充缺乏或失去正常功能的蛋白质，或抑制体内某
种离子通道基因表达，使心脏中的非起搏细胞具有自律性，使心脏的起搏和传导功能得以恢复。目前，利用基因产生心脏生物起搏活动的研究主要包括以下3 种方式。
1. 超极化激活的环核苷酸门控(HCN)基因转染
HCN 与cAMP 的结合物可以在一定电压范围内有效的增加内向电流[2]，HCN2 和HCN4 两者对cAMP 反应强烈，但HCN2 比HCN4 有更快的动力学，所以HCN2被广泛应用在目前的研究中。Qu 等[3]将一组动物的左心房整合了HCN2+绿荧光蛋白(GFP)的腺病毒注射，三四天后， 刺激迷走神经抑制窦房结后， 接受了HCN2+GFP 的动物产生了来源于注射部位附近的房性心律，且该心律对肾上腺素和毒蕈碱拮抗剂均有反应，而对照组没有此现象。此外，注射部位的心肌细胞显示If 电流比未注射部位的If 电流大100~1 000 倍，为了观察这样的起搏电流是否能够驱动房室阻滞后的犬心脏，Plotnikov 等[4]将4 只犬的左束支射了含有HCN2+GFP的腺病毒，4~7 d 后刺激迷走神经产生房室阻滞后，该组犬产生了来源于注射部位附近稳定的室性逸搏心律(60 次/min)，其频率明显快于对照组。通过免疫组织化学和物理方法均检测到注射部位有HCN2 的过度表达，此研究说明过度表达的HCN2 在心肌中可以产生类似If电流来驱动心脏。
2. 内向整流钾电流(Ik1)的抑制
成人心室肌细胞也有潜在的起搏活性，但是受到内向整流钾电流(Ik1)的抑制而处于负的膜电位状态，所以用抑制Ik1 的策略可以诱发豚鼠心脏产生自发性搏动[5]。Miake 等[6]通过替换Kir2.1 氨基酸序列中144~146 位的GYG 3 个氨基酸残基构建一个显性失活的突变体Kir21AAA，用腺病毒运载这个突变体注入豚鼠的左室，三四天后，在这类细胞中80%的钾电流受抑制，当钾电流受到抑制低于-5 mV时，细胞出现自发电活动，此时豚鼠的心跳起源于心室，心肌细胞动作电位的记录也表明单个心肌细胞具有4 期去极化和自主节律电活动的特点，其心电图表现为室性早搏的改变，心率比窦房结的节律快。以上实验说明应用腺病毒转染基因的方法抑制心室细胞的Ik1 电流，可将实验动物心室肌细胞转变有同步、节律电活动的起搏细胞，该研究为基因转染构建生物起博提供了证据。但是心肌细胞缺乏Ik1 时有可能产生竞争性的自身心律，室性早搏增多，复极离散度增加，心律失常增多，而且在降低IK1 的情况下，多种内向电流都可驱动心脏搏动。因
而，这种降低IK1 的方法有可能产生不可预料的节律[7]。
3、心肌细胞膜B 受体表达的上调
β2 肾上腺素兴奋可使内源性起搏电流(If)增加，引起心脏自动去极化的时间缩短，进而提高心率。Edelberg 等[8]将人的β2 肾上腺素受体cDNA 质粒转染到胎鼠的心肌细胞内，使心肌细胞膜的β2 受体过表达，增加自律细胞对内源及外源性肾上腺素的反应以提高心率，结果显示大鼠的心率加快40%。Edelberg 等[9]在此前研究的基础上，使用携带人类β2 受体的表达质粒直接注射到猪的心房，结果使试验组的心房出现节律性电活动，注射前为108 次/min，注射后达163 次/min，心率增快约50%(P < 0.05)。使心肌细胞膜的B 受体表达上调作用时间短，仅有一两天，是否能够在窦房和房室传导阻滞时有效地驱动心脏搏动尚未验证，该方法主要增加了内在起搏细胞电活动的频率，没有提供新的起搏点故不是真正的心脏起博，且β2肾上腺能受体除了作用于起搏电流外还作用于其他的儿茶酚胺敏感性电流，因而β2 肾上腺能受体过表达可能引发其他疾病[10]，故如何获得长期上调的β2 肾上腺素受体，并减少因此而增加的其他风险，尚需进一步研究。
二、细胞
细胞包括两种方法，一种是将供体有较高自主节律性的心脏细胞移植到受体的心肌细胞层，作为受体心脏新的起搏点替代功能已发生障碍的原有节律点，并启动心脏的电和机
械活动；另一方法是干细胞，干细胞经诱导分化成为具有起搏和传导功能的细胞，可替代或修复受损组织细胞的功能，恢复心脏的起搏和传导功能。
1、 起搏细胞移植
1）自体细胞移植：seifert张浩等[11]分离未成年猪窦房结细胞移植到自体右室近心尖部，能够提高完全性房室传导阻滞后幼猪的心室率，移植组室性自主心律高于对照组。经心内膜起搏标测证实，移植组室性自主心律起源于细胞移植部位。注射异丙肾上腺素后，移植组室性心律改变明显。自体细胞移植不存在免疫排斥和伦理学问题。
2）同种异体细胞移植：Ruhparwar 等[12]将受体犬制作成Ⅲ度房室传导阻滞模型后，再将标记后的胎犬心房包含窦房结细胞悬液移植到受体犬的左心室游离壁。心内电生理检查显示移植组的室性节律点由移植部位发出，说明这些移植细胞在受体心室壁上存活，注射异丙肾上腺素后心室率能够显著加快，说明这些细胞具有变时能力。在供体细胞和受体细胞之间有间隙连接蛋白43 的表达，说明两种细胞间有电连接形成。这一研究证实了细胞移植技术重建心脏起搏点的可行性。蔡军等[13]移植新生Yorkshire 猪心肌细胞能成功起搏射频消融his 束后的猪心室，但细胞移植组室性节律频率平均为95 次/min，与正常窦性心率160
次/min 还有一定差距，可能与移植细胞在新的微环境下功能受到抑制或者移植细胞与宿主细胞间的电学连接不够稳定有关。
3）异种细胞移植：林国生等[14]分离引产男婴右房组织(包括窦房结)，制成细胞悬液注入幼年猪左室游离壁后可起搏猪心室。免疫组织化学提示，胚胎心肌细胞在移植区存活。因心肌细胞表面存在B 和M 型受体，所以理论上移植的细胞能被神经体液因素所调节，从而可能成为具有频率应答式功能的“生物起搏器”。
2. 干细胞移植
1）成人间充质干细胞：骨髓间充质干细胞有着干细胞的共同特性：不断的自我更新、多向分化能力。Wang 等[15]发现间充质干细胞能够向心肌样细胞分化，形成缝隙连接，并可能替代宿主心肌细胞。临床前研究也证实成人间充质干细胞在合适的条件下可分化成具有起搏功能的窦房结细胞[16]。目前，在研究中还没有发现成人间充质干细胞具有诱导主要免疫反应的性质[17]，但成人间充质干细胞的免疫源性究竟如何，有待进一步的试验研究。Potapova 等[18]将调控鼠起搏电流基因(mHCN2)转染人间充质干细胞后，发现间充质干细胞能产生与If 电流相同的起搏电流，起搏窦性停搏的犬心脏。通过双膜片钳技术和免疫组
织化学染，发现人间充质干细胞在自身细胞之间与犬的左心室肌细胞之间均有连接蛋白43缝隙连接形成。目前，可通过体外贴壁培养，或根据细胞表面特异表达的分子，来获得相对较纯的间充质干细胞，以期体外定向诱导，研究它的发育机制，或用于临床。
2）胚胎干细胞：胚胎干细胞最早由Martin[19]于1981 年从小鼠的胚胎中分离出来。Banach 等[20]将胚胎干细胞诱导分化成心脏起搏细胞，其中81%的细胞出现了自发收缩。Kehat 等[21]移植诱导后的人胚胎干细胞能成功起搏射频消融his 束后的猪心室。Xue 等[22]的研究发现，具有电活动的供体人胚胎干细胞来源的心肌细胞，可以和受体中静止心肌细胞在功能上结成一体，出现节律性的电活动和收缩活动。将人胚胎干细胞来源的有起搏功能的细胞种植在豚鼠的左心室上，利用实时激动标测系统证实了电活动从注射部位向周围心肌的传播。但如何驱动胚胎干细胞向窦房结等自律细胞定向分化并且如何鉴别、分离和纯化需要进一步研究。
3 细胞移植的部位及路径问题
各种移植方式也存在各自的优点和缺陷。①经心外膜下肌肉注射：注射在直视下进行，最为直接可靠，便于术后分化细胞鉴定。但需要开胸，手术创伤大，术后伤口愈合时间长，
不符合生理性的要求，晚期心脏病患者往往难以承受手术的打击，而且有引起细胞回漏、诱导心律失常等不良反应。②经冠状动脉导入法：该术式创口小，操作简便，患者易于接受。但由于动脉血管有广泛的网状毛细血管连接，细胞是否能在靶组织处停留并生长有待于进一步研究以明确。③经心内膜下定点注射法：心内膜下肌肉注射法具有不需要开胸手术的优越性，但对心血管介入
技术要求相当高，注射位置难以固定，有致心脏穿孔和心律失常的危险性，且高压注射可引起移植细胞坏死；电机械导航系统(NOGA)可指引注射针管跨过主动脉瓣或三尖瓣，定位于心内膜表面，判断局部心肌的电活动及电传布以指导注射区域，可将细胞准确注射于左、右室壁或室间隔上。但该导管系统价格昂贵，从而限制了该项技术的应用。④经静脉注射法：静脉途径接近于无
创，Hofmann 等[23]将未分选的骨髓细胞用18F-FIX9 标记后，经外周静脉移植到患者体内，但在心肌中很少检测到标记细胞。此试验结果表明，经静脉注射法移植的效率较低下，仅有极少数的细胞能够到达靶组织，大量细胞可能随着血流迁移至其他器官，引起远隔器官不必要的血管新生，可能导致血管瘤、视网膜血管增生等并发症。⑤经冠状静脉窦
注射法：在血管内超声的引导下经冠状静脉窦进行细胞移植，为细胞移植开辟了新的途径。但经冠状静脉窦注射是逆血流方向进行，故细胞在局部滞留生长的概率更小。究竟通过何种路径才能使移植细胞长期存活、创伤最小，最符合生理性起搏的要求还有待于进一步的实验研究以证实。
三、 激素
Patel 等[24]发现内皮素1 和神经调节蛋白1 可使胚胎的心肌细胞定向分化为心脏传导系统细胞。神经调节蛋白1 还可上调心肌细胞之间缝隙连接因子40 的表达。Rentschler 等[25]在lacZ 基因标记心脏传导系统的小鼠中发现，lacZ 的表达能够显示心脏传导系统的发育和成熟过程，心内膜衍生的旁分泌因子能够促进有收缩能力的心肌细胞转化为有传导功能的细胞。
四、问题与展望
生物“起搏器”的研究还处于动物实验研究阶段，将它应用于临床实践中还有很多问题需要研究和解决，比如：并非100%的动物在导入目的基因后能够产生正常的心律，注射基因部位
普遍出现血肿；怎样获得高效、安全的基因转染载体？分离纯度高、分化潜能高的起搏细胞也是需要解决的技术难点；移植细胞定居生长的最佳微环境有待于进一步明确；被移植的细胞能否在心肌靶位置停滞并生长，而不转移到其他部位？细胞移植的安全性及其功能表达的持久性需要更长随访期的评价；细胞移植的最佳部位、移植数量、起搏功能的调控，同种异体或异种细胞移植所面临的免疫排斥反应也是其临床应用的障碍。虽然生物起搏技术的研究尚处于初级阶段，但其临床应用的前景是非常广阔的，这种生物起搏器可随机体的生理状态自动调整心率和房室同步，不会发生感染，电极脱位、断裂，心肌穿孔，不受年龄限制，不用更换电池和电极，也不受周围环境中的电磁场干扰；比电子起搏器更便宜、更安全、更灵敏、可通过心脏导管技术在创伤更小的情况下实现心脏生物起搏或消融后重建心脏生物起搏点，也可根据需要在心房内或心室内不同区域进行多部位移植，而达到缓慢型心律失常、心肌梗死甚至使心室搏动再同步化晚期难治性心功衰竭的目的，其操作的难度将远远小于植入三腔起搏器。也许细胞移植、基因和激素3 者联合的策略能够充分发挥各自的优势、取长补短，比如体外利用神经调节蛋白1 将胚胎心肌细胞或干细胞处理后再移植，可能提高细胞移植的疗效，再将细胞作为载体运送起搏基因到心脏产生起搏电流的同时还可以通过转染基因调控移植细胞的电生理功能。